HPLC
基本介紹：HPLC，high performance liquid chromatography，主要是利用液體(mobile phase)承載分析物，並與column中的stationary phase做分離的動作，最後在進行detection的動作，利用分光光度計或是mass來做分析。此外，HPLC能夠分析不適用GC的物質(不具揮發，熱中不穩定等)，對於分析十分便利
(1) solvent：
依照需求而選擇，並進行除氣(degas)的動作，避免氣泡影響HPLC的表現。此外，因為個物質對於solvent與stationary phase的分配係數不一，能夠利用改變solvent的方式，也就是所謂的gradient solvent，讓分離的效果更好。(若solvent始終如一，就稱做isocratic)
(2) sample injection
(3) column：依照不同的分離模式(mode)而有不同的構造。通常管柱前會有一個guard column，主要是用來保護後面的column，並且去除某些特定的物質。
分離的方式：
a. partition：利用分析物會在stationary phase以及mobile phase中做分配，造成分離。
關於管柱的packing，主要有兩個方式，第一種稱做liquid partition，只利用adsorption的力量將stationary phase故定在particle上；另一種稱做bonded-phase，將氫氧根與silica particle加熱產生鍵結→其stationary phase有較高的穩定性。
依照溶液的性質，將分離分成兩類，normal phase(stationary phase為極性物質)以及reverse phase(stationary phase為非極性物質)。其選擇主要在於分析物的狀況，在第984頁上有比較各官能基的極性大小。(小→大：烷→芳香ㄊㄧㄥ→鹵烷→醚→酯，醛，酮→醇，胺→醯胺→水)
b. adsorption：主要利用silica或alumina等物質，將分析物做吸附的動作→造成分離的效果
c. Ion exchange：利用aqueous solution→管柱表層具有帶電荷的物質，會吸引分析物中帶有電荷者→移動的速度變慢而分離
d. Size exclusion：主要利用孔徑的大小，進行分離的動作。大分子較快，小分子困在孔洞中，速度較慢
e. Affinity：管柱上有專一性的affinity ligand→捕捉特定的物質，最後在改變mobile phase的成分→將我們要的物質elute出來
(4) Detection
a. UV detector：常利用物質吸收UV的特性→測吸光度
b. Mass：質譜儀→定量，定性
FPLC
FPLC，fast protein liquid chromatography，是一種分析蛋白質常用的方式。與一般的HPLC原理類似，但是結構對蛋白質更為友善(不用steel，而用glass為column)→常用來分離biologically active分子
沒有留言:
張貼留言