組織學-1-1 Techniques
1. 基本步驟：
(1) fixation：利用共價鍵的生成，讓物質的相對位置固定
LM：fomalin的醛基能與一級胺作用
EM：osmium tetraxide：能與雙鍵CC產生cross link
(2) dehydration：利用alcohol
(3) embedding：利用parrafin(石蠟)或是plastic resin(樹脂)包埋
(4) sectioning：利用microtome做切割
(5) mounting：光學用載玻片，電顯用copper grid
(6) staining：光學用染劑法；電顯用鉛、鈾等原子序大的金屬，因放出的電子較多能夠增加對比度
2. 染色：
(1) dye染劑染色法
→hematoxylin與eosin：H E染色法
(a) hematoxylin帶正電，染負電物質(ex.核酸)，藍色
(b) eosin帶負電，染正電物質(ex. 蛋白質中的Arg , Lys)
→acidic dye：帶負電荷，染basic substance
Basic dye：帶正電荷，染acidic substance
(2) enzyme histochemistry
→利用酵素作用mechanism，給予適當的substance以偵測該酵素的位置
(3) immunocytochemistry
→設計抗體辨識特定的物質，在利用螢光呈色，標示該物質的位置
→依照螢光物質接的位置分成direct與indirect兩種
a. direct：primary antibody上有螢光物質，直接辨識target
b. indirect：primary antibody辨識target，再加入帶有螢光物質的’secondary antibody辨識primary antibody
(4) FISH(fluorescent in situ hybridization)
→加入一段帶有螢光的DNA probe(探針)，會與其互補的DNA，mRNA片段hybridize
→藉此可以偵測特定gene，mRNA的位置(ex,唐氏症的檢測)
(5) autoradiograph
→利用放射性標定，觀察生化路徑或是標定酵素位置
→加入標定的amino acid，即可觀察細胞中合成蛋白質的路徑
3. 顯微鏡介紹
(1) 光學顯微鏡(LM)：就是光學顯微鏡！
(2) 螢光顯微鏡
(3) 共軛焦顯微鏡：能夠聚焦在特定的layer，以得到較好的畫面
(4) 原子力顯微鏡：atomic force
→利用雷射與tip，可以偵測物體的surface情況
(5) 電子顯微鏡：分成TEM(穿透式)，SEM(掃描式)
→利用電子束取代光源
→因為使用電子束，所以要抽真空避免干擾，故無法觀察活體細胞
4. 細胞胞器的分離
(1) 將細胞打碎後，使用離心機(centrifuge)，依照其沉降係數做分離
(2) 要注意離心的時間，太長會全沉降，太短解析度差
(3) 可以使用sucrose溶液的gradient，胞器將會沉至其相近s值的layer
(4) 離心機的單位以g值較好，轉速所造成的效果不同機器有差異
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