一‧recombinant gene:
原料:vector(plasmid),restriction enzyme , ligase ,
原料介紹:
Restriction enzyme:細菌為了對抗phage而產生的自保機制,切割特定的片段,通常呈現palindromic(回文)
例如:ECOR1:GAATTC
Vector:通常會帶有selectable marker,以用來選殖,例如螢光基因,抗生素(amp resistance),果蠅的橙色眼睛等等。本實驗是採用抗抗生素基因
步驟一:使用restriction enzyme切割質體與目標基因,產生sticky end,並加入ligase,連接兩個片段
目前的情況:vector成功接到或是recirculate
步驟二:transformation:利用heat shock或是電極處理,使vector進入細菌中
目前的情況:質體進入或是沒進入細胞中
步驟三:選殖:為了取得目標的細胞,必須做選殖的動作
Vector得進入與否:利用抗生素的plate
Vector是否接上目標的基因片段:能使用藍白篩的機制,若目標基因進入質體,會切割lacZ基因,使得他無法將X-Gal 分解,結果產生無色的菌落;若呈現藍色的菌落,表不是我們要的菌落
二‧gene cloning:PCR:polymerase chain reaction
使用的polymerase:taq:耐高溫
三步驟:
第一:雙股打開:94度,打破氫鍵
第二:接上primer:50幾度
第三:快速複製:72度,taq最有效的溫度
三‧DNA sequencing
利用sanger法
步驟:
使用四支試管:ddATP ddTTP ddCTP ddGTP
加入polymerase,複製直到ddNTP,複製中止
利用電泳,讀取每一個片段最尾碼,排出基因的序列
四‧biotechnology
Cloning
Molecular pharming
Transgenetic anomals
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