生化筆記‧chapter3
一‧前言：
1. system biology：以系統化的方式進行研究，使用bioinformatics的方式，整合各領域的研究
2. translational medicine：轉譯醫學，連結基礎研究至臨床應用
二‧胺基酸
1. 以α胺基酸為主(氨基接在α碳上)，因為β胺基酸的自由度太大，不易組成穩定的結構
2. 以L form的胺基酸存在，其D，L乃由glyceraldehyde為基準(relative configuration)，與其旋光性沒有直接的相關聯(D，L只是自然界的一種選擇)
3. 20種胺基酸：(略)，以下列出幾點較特別的性質
→能進行磷酸化的胺基酸：含OH：Ser Thr Tyr
→具有兩個chiral center：Ile Thr
→第21號胺基酸：Selenocysteine：cys的硫由Se取代
4. 胺基酸的吸光：
→帶芳香族在280nm的紫外光處有強吸光，Trp > Tyr > Phe
→可用來測定蛋白質的濃度(假定各蛋白質Trp，Tyr的比例差不多)
→在側定peptide時，因不一定含有Trp或Tyr，故選擇220nm作側定
5. 胺基酸的解離：
→胺基酸為zwitterion，在特定pH時可一端帶負電，一端正電
→具有多個可解離之氫離子，當pH=pKa時，釋放出氫離子而改變電性
→當達某特定pH，其帶電量為0，此時的pH稱為PI(等電點)
→等電點的計算為『進入不帶電』的pKa與『離開不帶電』的pKa之平均
→有些R group亦帶有可解離之氫離子，情況更為複雜(背順序!!!)
三‧蛋白質分析
1. 表示法：左端為N端，右端為C端
2. 分析的方法1：初步分離
→利用硫氨鹽析法(ammonium sulfate)，將蛋白質鹽析沉澱(salting out)
→改變鹽濃度與離心，取得想要的protein
→利用dialysis法，去除吸附在蛋白質上的salt，以利後續的分析
3. 分析的方法2：column管柱分析
→gel filtration：利用分子大小進行分離。管柱多孔洞，分子較小者會trap於其中，在管柱的時間越長，可取得自然狀態的蛋白質
→ion exchange：利用帶電量進行分離，管柱上有帶電的擔體
DEAE(anion exchanger)：帶正電，pH不能大於9
CM(cation exchanger)：帶負電，pH不能小於5
→affinity法：利用蛋白質與ligand的專一性結合作分離，純化佳
→hydrophobic法：利用疏水性相結合的特性
→HPLC：有兩種方式
a. normal phase：管柱為親水性，mobile phase為有機溶劑
b. reverse phase：管柱為疏水性(wax)，mobile phase為親水性
4. 分析的方法3：電泳electrophoresis (分離，定分子量)
→用途：分離，定性分析(電泳會造成變性)
→電泳膠體：acrylamide，濃度越高，孔徑越小(見實驗講義)
→公式：μ=V(速率)/E(電場)=Z(帶電量)/f(泳動阻率)
泳動阻率受到形狀，大小影響
→SDS page：SDS為一介面活性劑，會插入胺基酸長鏈中，除去電荷的效應；同時也破壞蛋白質的二，三級結構成為直鏈(不包括雙硫鍵)
結論是：分子量越大，跑越慢
→IEF：等電點電泳：使蛋白質依照pI的不同而分離
利用pH梯度進行電泳，當pH=PI時不帶電，停止泳動
→二維電泳：先進行IEF後，在進行SDS，順序不可顛倒!!!!!!
與Mass為蛋白質體學的基礎!!!!!!
5. 分析的方法4：Mass (定蛋白質序列)
→原本傳統的Mass不適合蛋白質分析(高溫氣化)，直到MALDI TOF與ESI兩種方式的誕生，才解決這個問題
→MALDI TOF：經過trypsin切割後的peptide置放於一matrix，可吸收peptide氣化後多餘的能量，避免蛋白質被分解。接著計算其飛行的時間(Time Of Fly)，判斷質量。
→ESI：electrospray ionization：將peptide包附於液滴，後進入Mass作分析
可藉由各碎片的質量，推算出peptide的序列，後再由基因庫得之完整序列→得到蛋白質
6. 分析的方法5：免疫染色法ELISA與Western Blot (蛋白質定量與有無)
→ELISA與Western Blot皆利用抗體辨認特定蛋白質，在使用『辨識抗體的抗體』(secondary antibody)接上先前的抗體。若secondary antibody為呈色劑，可藉由顏色的有無或深淺來判斷蛋白質的有無與量的多寡。
→Western Blot為將電泳膠體上的蛋白質吸附到nitrocellulose上，以方便進行上述的抗體染色過程(膠體太軟了)
→ELISA：將樣本覆蓋於杯底，並使用抗體染色法來定性定量
7. 分析的方法6：protein的定量
→由光譜分析法：280nm
→Lowry method：銅離子，Folin試劑會與蛋白質的peptide bond作用，產生藍色，藉由分度吸光器來判斷protein的量
→Ninhydrin法：與N端作用，形成藍紫色複合物
四‧蛋白質的一級結構決定
1. 決定分子量：
a. SDS-PAGE：蛋白質denature後測得，subunit分離
b. Gel filtration：藉由在管柱的時間推斷分子量，為nature狀態
c. Ultracentrifugation：利用蛋白質的沉降速度，推出蛋白質的分子量
※a,b兩法常搭配使用，可推斷蛋白質是由多少subunit所組成!!!
2. 決定胺基酸的序列：
a. Sanger法：加入FDNB(fluorodinitrobenzene)僅辨識N端的第一個胺基酸
b. Edman法：加入PTH，與N端作用，可一個一個將胺基酸拆下來，分析得到胺基酸整個序列
c. 現在多利用定序幾段peptide，回推到genome的資料庫，直接調出該蛋白質的序列
3. 雙硫鍵位置的確認
a. 加入trypsin作切割，並利用還原法破壞雙硫鍵後，利用Edman法定出蛋白質序列，將這些片段作蛋白質電泳，得到一張圖
b. 接著將這段peptide用trypsin切割，不破壞雙硫鍵後進行電泳，比對即可知道，消失的片段由雙硫鍵聯接
c. 破壞雙硫鍵的方法有二
(a) 氧化法：加入performic acid
(b) 還原法：加入β-mercaptoethanol或是DTT還原成SH；並加入iodoacetate乙醯化後保護之
4. 酵素的切割：老師說要背這兩個
Trypsin：切K(lys)與R(Arg)的C端
Cyanogen bromide：切Met的C端
五‧胺基酸的化學合成
→Fmoc的作用：保護amino acid的N端，經由有機鹼可沖去
→DCC的作用：活化amino acid的C端，使之與N端作用
→步驟如下：
(a) 先將用Fmoc保護的amino acidC端接在樹脂上
(b) 加入有機鹼去掉Fmoc的保護
(c) 準備另一管Fmoc保護的amino acid，加入DCC活化C端
(d) 將這管的amino acid加入，生成peptide bond
(e) 利用同樣的原理，可以一直接下去。最後再用HF切掉樹脂
(f) 為求效率，現在通常設計兩個胺基酸接在一起的樹脂
六‧蛋白質體學：proteomic
1. 現代蛋白質體學的發展主要導因於：二維電泳與Mass技術的發展
2. 定義：某一組織或細胞在一定條件時間下所表現的所有蛋白質，其相關言就稱proteomics
3. 應用：(這題考古題似乎有)
a. 大規模鑑定蛋白質
b. 分析不同狀態的細胞呈現之蛋白質差異(ex. Tumor cell)
c. 開發藥物，研究未知蛋白的功能
4. 基因不能申請專利；但研究出某基因的功能可申請專利
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