胞生 第二份
一‧總論：物質的運輸
→對於細胞而言，cytosol為胞內，蛋白質若穿過一層膜則為胞外。故就細胞的角度而言，從cytosol進入ER就屬於胞外了
→[inside→inside]：由cytosol→cytosol，細胞核
[inside→outside]：由cytosol→ER
[outside→outside]：由內膜系統→細胞外
→蛋白質穿過膜：
a. 要如何引導蛋白質抵達其目的地？
cis factor：signal sequence：蛋白質上有一段特定的訊息
trans factor：其他motor或chaperone的輔助
b. 穿過膜的模式有兩種
→co-translational protein translocation：
→蛋白質一邊合成，一邊進行穿膜的動作
→post-translational protein translocation：
→蛋白質合成後才穿過膜，但注意蛋白質要呈『unfolding』的狀態
二‧研究蛋白質轉移的方法
- cell free system
將細胞內的胞器分離，在試管中進行反應，可單獨觀察某特定部位的功能；細胞中，反應會連續進行，無法精確的觀察每個部位特定的功能
- 研究cis factor的影響
將蛋白質的signal sequence換成別的，觀察蛋白質最後的目的地。若蛋白質本身不帶有信號，應該會送到新signal所指定處；若蛋白質還送其他因素調控，結果就會有差異
- 第14頁ppt的實驗：
目標：將標定後的蛋白送入細胞後，觀察這段蛋白質在進入前後有何差異
結果：跑電泳後發現進入細胞內的蛋白質片段較小，表示signal sequence被切掉了
- cross linking ：研究在蛋白質轉移的過程中，是否有其他factor會bind在序列上，影響其運輸
- genetic：
利用突變特定基因的方式，可以找到影響protein translocation的分子
1. 內質網可以分成RER(粗糙內質網)與SER(平滑內質網)
→命名差異在於其上附著粒線體的有無
→RER與SER相連，部分蛋白質可共享，部分不行，因而造成功能上的差異
→不同細胞需要不同比例的ER，腺體細胞因分泌大量蛋白質，RER較多
2. SER：平滑內質網：以管狀為主
a. 合成固醇類的hormone：腎上腺皮質素，性腺
b. 鈣離子的儲存(肌漿網)：骨骼肌，心肌
c. 解毒作用：肝臟細胞
d. 上具有G6Pase，可以促進glucose的釋放
3. RER：粗糙內質網：由cisternae堆疊而成，有許多功能
a. 功能1：附著於上的核醣體負責合成分泌到外、integral protein、內膜系統間的蛋白質；游離的核醣體則主要負責內用的蛋白質合成
b. 功能2：合成後的蛋白質，要如何通過ER的膜呢？
(採用co-translational的機制)
步驟總論
→一段mRNA在一個游離的ribosome上，開始進行轉譯
→這時，SRP(signal recognition particle)會bind在signal sequence上，使得轉譯暫時中止，並與SRP的receptor結合，附著到ER上
→GTP水解，核醣體與ER上的translocon(通道)結合，使得plug移開，多肽鏈開始進入ER的lumen中，轉譯繼續
→進入lumen後，signal sequence被切除，chaperone分子協助其折疊
細節討論
(1) Translocon
→為一個蛋白質的複合體，側面像沙漏，並且有個plug會塞住孔道。
→負責(1)辨識signal peptide (2)結合並釋放ribosome (3)協助多肽鏈進出ER lumen
(2) 上述機制為送出細胞的蛋白質，若為integral protein，則可分成兩種
→N端在內，C端在外
(a) 與前述機制差不多
(b) 通常integral protein與膜鑲嵌的位置，為疏水性結構。當這段hydrophobic的結構被轉譯出來後，會與translocon上的seam作用，使其打開側邊，dissolve在脂雙層中
(c) 此外，也可利用鑲嵌在膜兩側的電荷，來確定其方向的正確
→N端在外，C端在內
(a) 麻煩的地方在於N端在外，然而N端本身會先進入lumen
(b) 這類型的protein需要在translocon中進行reorientation，主要是利用電荷來導引多肽鏈的轉向，使得N端轉到外面
(3) 進入lumen後，chaperone會協助多肽鏈的折疊
→ER內部環境較接近胞外，蛋白質較易被氧化，所以需要這些分子來協助摺疊，避免破壞
c. 功能3：生物膜的合成
→ER上的integral protein負責分泌lipid以補充內膜系統，亦會加上一些醣類，決定vesicle的運送目的地
→然而，內膜系統各部分的lipid其實比例仍有差異，所以需要一些機制讓lipid補充時，可以符合該區膜的組成狀況
(1) 利用酵素把lipid的頭給換掉
(2) 在形成vesicle時，該區的lipid組成比例調整成目標區的比例
(3) Phospholipid transfer protein：可以把lipid移到另一個膜上
→→對粒線體，葉綠體相當重要
d. 功能4：RER的glycosylation：N link
→這裡進行的N link glycosylation基本上是固定的，進一步的修飾與O link的修飾則要等到高基氏體
→簡言之，RER先利用酵素將寡糖支鏈給製造出來，然後藉由磷酸化的方式，將寡糖鏈接到蛋白質上(Asn)
→此外，glycosylation在quality control中亦扮演角色，可與chaperone結合，協助其摺疊；若摺疊錯誤，會再進行一次；若錯誤太多次，就會被送到cytosol，接上ubiquitin後，經由proteasome處理掉
e. 功能5：RER的quality control
→品質管理：確保蛋白質的摺疊是正確的，並將錯誤的重新摺疊亦或丟到cytosol分解掉
→UPR機制：unfolded protein response
(1) 發生時機：當摺疊錯誤的蛋白質數量超過細胞處理的速率時
(2) 目標：減少蛋白質的產生，減緩品管的壓力；增加檢查的chaperone
(3) 參與：BiP(一種chaperone)，sensor
(4) 詳細機制：
→在平常，BiP會接在sensor上；但是當錯誤摺疊的蛋白質出現，BiP會脫離sensor與蛋白質結合，sensor因此活化產生dimer
→dimer發出signal的方式：
到cytosol：sensor可磷酸化translational initiation factor (eIF2e)，使得translation受到抑制，進而使蛋白質合成速率下降，減少QC的壓力
到nucleus：sensor的head domain會進入nucleus，活化特定的mRNA，促進協助protein folding的物質生成，舒緩ER的壓力
(5) 如果這些方法仍然沒辦法減緩ER的壓力，將促使細胞進行凋亡
(6) 許多疾病是因為蛋白質的QC沒有作好，導致蛋白質無法發揮功能
4. 總整理→RER的功能如下
(1) 利用膜上的核醣體合成蛋白質
(2) 透過ER進行蛋白質的運送
(3) 生物膜的合成
(4) 蛋白質的修飾(ex. glycosylation)
(5) 蛋白質的品質管理(QC)
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